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免疫組化之組織處理、切片和染色需知

點(diǎn)擊次數(shù)：13143 發(fā)布時(shí)間：2016/8/24 9:41:02

上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司定期更新技術(shù)文章，為廣大客戶(hù)提供技術(shù)參考；今日，我司要為大家講解免疫組化之組織處理、切片和染色的相關(guān)問(wèn)題，希望對(duì)您有所幫助：
1.組織處理

恰當(dāng)?shù)慕M織處理是做好免疫組化染色的先決條件，也是決定染色成敗的內(nèi)部因素，在組織細(xì)胞材料準(zhǔn)備的過(guò)程中，不僅要求保持組織細(xì)胞形態(tài)完整，更要保持組織細(xì)胞的抗原性不受損或彌漫，防止組織自溶。如果出現(xiàn)自溶壞死的組織，抗原已經(jīng)丟失，即使用很靈敏的檢測(cè)抗體和高超的技術(shù)，也很難檢出所需的抗原，反而往往由于組織的壞死或制片時(shí)的刀痕擠壓，在上述區(qū)域易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。
1) 組織及時(shí)取材和固定　
組織標(biāo)本及時(shí)的取材和固定是做好免疫組化染色的關(guān)鍵步，是有效防止組織自溶壞死，抗原丟失的開(kāi)始，離體組織應(yīng)盡快的進(jìn)行取材，2h內(nèi)，取材時(shí)所用的刀應(yīng)銳利，要一刀下去切開(kāi)組織，不可反復(fù)切拉組織，造成組織的擠壓，組織塊大小要適中，一般在2.5cm×2.5cm×0.2cm，切記取材時(shí)組織塊寧可面積大，千萬(wàn)不能厚的原則，(也就是說(shuō)組織塊的面積可以大到3cm×5cm，但組織塊的厚度千萬(wàn)不能超過(guò)0.2cm，否則將不利于組織的均勻固定)。固定液快速滲透到組織內(nèi)部使組織蛋白能在一定時(shí)間內(nèi)迅速凝固。從而完好的保存抗原和組織細(xì)胞形態(tài)。
對(duì)于固定液的選擇，原則上講，應(yīng)根據(jù)抗原的耐受性來(lái)選擇相應(yīng)的固定液，但除非是專(zhuān)項(xiàng)科研項(xiàng)目，在病理常規(guī)工作很難做到這一點(diǎn)，因?yàn)椴±淼脑\斷和鑒別診斷都是在常規(guī)HE病理診斷的基礎(chǔ)上決定是否進(jìn)行免疫組化的染色，而HE染色的常規(guī)組織處理是采用10%的中性緩沖福爾馬林或4%緩沖多聚甲醛4倍于組織體積進(jìn)行組織固定，利用其滲透性強(qiáng)，對(duì)組織的作用均勻進(jìn)行固定，但組織固定時(shí)間在l2h內(nèi)，一般固定時(shí)間不應(yīng)超過(guò)24小時(shí)。隨著固定時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)組織抗原的檢出強(qiáng)度將逐漸降低。
2) 組織脫水、透明、浸蠟　
組織經(jīng)固定后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和包埋。掌握的原則是脫水透明要充分但不能過(guò)，浸蠟時(shí)間要夠，溫度不能高，否則造成組織的硬脆使組織切片困難，即使能切片，由于組織的硬脆，也使切片不能完好平整，染色過(guò)程中極易脫片，對(duì)免疫組化染色抗原的定位及背景都不利，所以無(wú)水酒精脫水和二甲苯透明的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，正常大小的組織無(wú)水酒精脫水lh×3次，二甲苯透明lh×2次即可，浸蠟及包埋石蠟溫度不要超過(guò)65℃。
2.切片
組織得到很好處理后在進(jìn)行切片之前還應(yīng)對(duì)玻璃片進(jìn)行處理，由于我們檢測(cè)抗原是多種多樣的，因染色操作程序復(fù)雜，時(shí)間較長(zhǎng)，有些抗原是要進(jìn)行各種抗原修復(fù)處理，如微波、高壓、水溶酶等，玻片如果得不到很好的處理，將易造成脫片，為保證免疫組化實(shí)驗(yàn)的正常進(jìn)行，要求在貼片前對(duì)載玻片作適當(dāng)處理，必須在清洗干凈的玻片上進(jìn)行粘合劑的處理以防脫片。
1)Poly-L-Lysine (多聚左旋賴(lài)氨酸)　　
一般采用分子量30000左右的0.5%多聚賴(lài)氨酸，也可用試劑公司出售的其濃溶液以1：10去離子水稀釋。方法是將玻片浸泡其中，傾盡余液，在60℃溫箱中烤干備用，此方法的優(yōu)點(diǎn)是可以用于多種組織化學(xué)、免疫組化及分子學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用，粘貼效果，但價(jià)格稍貴。
2)明膠硫酸鉻鉀法　
將2.5g明膠加熱溶于500ml蒸餾水中，完全溶解冷卻后加入0.25g硫酸鉻鉀攪勻充分溶解即可使用。方法是將玻片浸泡其中2 min，取出控盡液體入溫箱中烤干備用。此法價(jià)格便宜、方法簡(jiǎn)單，任何實(shí)驗(yàn)都可以使用，特別適用于大批量的使用，但應(yīng)注意，如果液體變藍(lán)或粘稠狀停用。
3)APES (3-氨丙基-乙氧基甲硅烷)　　
此法必須現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈玻片入1:50丙酮稀釋的APES中，浸泡20s，取出稍停再入丙酮或蒸餾水中刷去末結(jié)合的APES晾干即可。用此方法粘合的玻片應(yīng)垂直烤片不能平拷，否則組織片中易出現(xiàn)氣泡。
切片必須保持切片刀銳利，切片要薄而平整、無(wú)皺摺、無(wú)刀痕，如有上述問(wèn)題的切片在進(jìn)行免疫組化染色都將出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象，切片厚度一般為3~4μm，切好的切片在60℃溫箱中過(guò)夜，注意烤片的溫度不宜過(guò)高，否則易使組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，而產(chǎn)生抗原標(biāo)記定位彌漫現(xiàn)象。
3.免疫組化染色
S—P免疫組化染色試劑盒采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過(guò)氧化物酶及底物色素混合液來(lái)測(cè)定細(xì)胞和組織中的抗原。
S—P免疫組化染色步驟：
1) 石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS(pH7．4)沖洗三次，每次3分鐘(3×3’)。
2) 根據(jù)每一種抗體的要求，對(duì)組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)。
3) 每張切片加1滴或50ul過(guò)氧化酶阻斷溶液(試劑A)，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，室溫下孵育10分鐘。
4) PBS沖洗3×3’。
5) 甩去PBS液，每張切片加1滴或50ul的非免疫性動(dòng)物血清(試劑B)，室溫下孵育10分鐘。
6) 甩去血清，每張切片加1滴或50ul的抗體(用戶(hù)自選)，室溫下孵育60分鐘或4℃過(guò)夜，建議參閱每種抗體的說(shuō)明書(shū)。
7) PBS沖洗3×5’。
8) 甩去PBS液，每張切片加1滴或50ul生物素標(biāo)記的第二抗體（試劑C），室溫下孵育10分鐘。
9) PBS沖洗3×3’。
10)甩去PBS液，每張切片加1滴或50ul鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液(試劑D)，室溫下孵育10分鐘。
11)PBS沖洗3×3’。
12)甩去PBS液，每張切片加2滴或100ul新鮮配制的DAB或AEC溶液，顯微鏡下觀察3—10分鐘，陽(yáng)性顯色為棕色或紅色。
13)自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，0.1％HCL分化，0.1％氨水或PBS沖洗返藍(lán)。
14)如果用DAB顯色，則切片經(jīng)過(guò)梯度酒精脫水干燥，(二甲苯透明)，中性樹(shù)膠封固；如果用AEC顯色，則切片不能經(jīng)酒精脫水，而直接用水性封片劑封片。

上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司具有完善的實(shí)驗(yàn)技術(shù)開(kāi)發(fā)平臺(tái)，成熟的抗原、抗體研發(fā)系統(tǒng)，熟練掌握各種酶聯(lián)技術(shù)，結(jié)合公司的研發(fā)團(tuán)隊(duì)，可以有效的保證公司產(chǎn)品強(qiáng)的穩(wěn)定性和高的準(zhǔn)確性，同時(shí)又具有*有競(jìng)爭(zhēng)力的價(jià)格。公司目前可以提供生化試劑、分子生物學(xué)試劑及試劑盒，各種抗體及免疫學(xué)試劑盒、實(shí)驗(yàn)耗材等多門(mén)類(lèi)上萬(wàn)種產(chǎn)品，產(chǎn)品涉及分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)等生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。如果您對(duì)我司的產(chǎn)品感興趣，歡迎來(lái)電咨詢(xún)。
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