以下是影響ELISA檢測的關(guān)鍵因素，也是眾多ELISA 用戶在實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常遇到的問題及解決方案：
Q1：為什么所有試劑和檢測樣本要平衡至室溫后再進(jìn)行加樣操作？
A1：溫度是ELISA結(jié)合反應(yīng)的重要影響因素。為了使所有樣本在一致的溫度下反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)前務(wù)必將所有試劑平衡至室溫，包括檢測樣本。避免因溫度的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)差異而導(dǎo)致ELISA檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確。
Q2：為什么標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較差？
A2：按照推薦方式保存標(biāo)準(zhǔn)品；溶解標(biāo)準(zhǔn)品之前需短暫離心，徹底收集粉末；確保標(biāo)準(zhǔn)品完全溶解和混勻（大約10min），然后再進(jìn)行后續(xù)的系列稀釋步驟，確保每一步都充分混勻且精確移液；顯色的恰當(dāng)終止；選擇合適的數(shù)學(xué)擬合方程繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
Q3：ELISA實(shí)驗(yàn)為什么必須設(shè)置復(fù)孔？
A3：為獲得更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，強(qiáng)烈建議標(biāo)準(zhǔn)品及樣本進(jìn)行復(fù)孔檢測。
因?yàn)閺?fù)孔檢測可以：
★計(jì)算平均值，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確；
★解決實(shí)驗(yàn)中誤操作造成的跳孔現(xiàn)象；
★計(jì)算CV值，對實(shí)驗(yàn)的操作和試劑盒的精密度進(jìn)行評估。
Q4：為什么實(shí)驗(yàn)過程中孵育、洗滌需要振蕩？如何振蕩？
A4：振蕩孵育使反應(yīng)更充分，振蕩洗滌使背景更干凈。建議使用酶標(biāo)專用96孔微孔板振蕩器。
孵育過程振蕩，可以加快、加強(qiáng)抗原抗體間的相互碰撞接觸，使得反應(yīng)過程更加完全，OD值通常會(huì)比未振蕩孵育的結(jié)果要高；洗滌過程振蕩，可以使洗板更干凈，在很大程度上能降低背景值，同時(shí)可以提高試劑盒檢測的靈敏度。 具體操作請參見說明書或致電勁馬生物
Q5：何時(shí)終止ELISA反應(yīng)？
A5：ELISA實(shí)驗(yàn)*終需要酶催化底物顯色反應(yīng)來完成，在*佳時(shí)間終止反應(yīng)是ELISA實(shí)驗(yàn)成功的重要因素。在HRP-TMB酶反應(yīng)系統(tǒng)中，當(dāng)濃度標(biāo)準(zhǔn)品顏色不再變深，倒數(shù)2-3個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品顏色開始有淺藍(lán)色時(shí)，便需要終止反應(yīng)；或者也可以根據(jù)濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔在620nm的OD值來決定，OD620=0.9-0.95之間時(shí)即可終止。
Q6：為什么酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)必須選用雙波長？
A6：首先，酶標(biāo)儀使用前務(wù)必預(yù)熱10-15min，使測讀結(jié)果更穩(wěn)定。其次，ELISA實(shí)驗(yàn)采用雙波長測定吸光度，可以排除單波長檢測時(shí)的測定干擾（標(biāo)本的濃度，干擾色等）。一般采用波長作為參照波長，在參照波長下，檢測物的吸光值*小，檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收；因此，雙波長測定，可限度的消除指紋、雜質(zhì)及不透光的物質(zhì)對酶標(biāo)儀讀數(shù)帶來的誤差，以保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。
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