細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融,實驗證明這樣可以大限度的保存細胞活力。目細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑,這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性,加上緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外,減少細胞內(nèi)冰晶的形成,從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復蘇細胞應采用快速融化的方法,這樣可以bao證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化,避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損傷。
細胞復蘇是一個簡單的試驗操作,但操作中也有許多需要注意的事項,在實驗操作中注意細小的問題,才能使復蘇后的細胞保持良好的狀態(tài),針對細胞復蘇應該注意以下幾點:
1. 可以提把需要的體積的培養(yǎng)液放到培養(yǎng)瓶里,擰松瓶蓋,放到孵箱里30分鐘--1個小時;
2. 為防止凍存管在升溫時出現(xiàn)爆裂等情況,可以在放入水浴就把超凈臺里的蓋子擰松一下然后再擰上;
3. 水浴溫度37℃左右。
一、凍存和復蘇的原則:慢凍快融
當細胞冷到零度以下,可以產(chǎn)生以下變化:細胞器脫水,細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高,并在細胞內(nèi)形成冰晶。
如果緩慢冷凍,可使細胞逐步脫水,細胞內(nèi)不會產(chǎn)生大的冰晶;如果快速冷凍的話,細胞內(nèi)就會產(chǎn)生大的冰晶,大結(jié)晶會造成細胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融,目的是防止小冰晶形成大冰晶,即冰晶的重結(jié)晶。
二、慢凍程序
1. 標準程序:采用細胞凍存器
當溫度在-25 ℃以上時,1~2 ℃/min;
當溫度達-25 ℃以下時,5~10 ℃/min;
當溫度達-100℃時,可迅速放入液氮中。
2. 簡易程序:將冷凍管(管口要朝上)放入紗布袋內(nèi),紗布袋系以線繩,通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口,按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度,在40 min內(nèi)降至液氮表面過夜,次日早晨投人液氮中。
3. 傳統(tǒng)程序:冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽cahng期儲存。
三、低溫保護劑的應用
在細胞凍存時加入溫保護劑,能大大提高凍存效果。
常用的低溫保護劑是DMSO,它是一種滲透性保護劑,可迅速透入細胞,提高胞膜對水的通透性,降低冰點,延緩凍結(jié)過程,能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)透出細胞外,在胞外形成冰晶,減少胞內(nèi)冰晶,從而減少冰晶對細胞的損傷。
四、細胞凍存方法
1. 預先配制凍存液
(1)10%DMSO + 細胞生長液(20%血清+基礎培養(yǎng)液)
(2)10%甘油+ 細胞生長液(20%血清+基礎培養(yǎng)液)
2. 取對數(shù)生cahng期細胞,經(jīng)胰酶消化后,加入適量凍存液, 用吸管吹打制成細胞懸液(1×106 ~ 5 ×106細胞/ml)。
3. 加入1 ml細胞于凍存管中,密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。液氮chang期保存。
五、保存細胞的復蘇方法
1. 快速解凍
凍存細胞從液氮中取出后,立即放入37℃水浴中,輕輕搖動冷凍管,使其在1 分鐘內(nèi)全部融化(不要超過3 分鐘)。
2. 解凍后的細胞可直接接種到生長培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶中直接進行培養(yǎng),24小時后再用新鮮培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液,以去除DMSO。
3. 如果細胞對冷凍保護劑特別敏感
解凍后的細胞應先通過離心去除冷凍保護劑,然后再接種到生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。
原創(chuàng)作者:上海恒遠生物科技有限公司