細(xì)胞破碎技術(shù)是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁,使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù),是分離純化細(xì)胞內(nèi)容合成的非分泌型生化物質(zhì)(產(chǎn)品)的基礎(chǔ)。結(jié)合重組DNA技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)上的重大進(jìn)展,以認(rèn)為很難獲得的蛋白質(zhì)現(xiàn)在可以大規(guī)模生產(chǎn)。
目已發(fā)展了多種細(xì)胞破碎方法,以便適應(yīng)不同用途和不同類型的細(xì)胞壁破碎。 破碎方法可規(guī)納為機(jī)械法和非機(jī)械法兩大類,一起來學(xué)習(xí)下吧。
機(jī)械法:
1.高壓勻漿破碎法(homogenization)
高壓勻漿器是常用的設(shè)備,它由可產(chǎn)生高壓的正向排代泵(positive displacenemt pump)和排出閥(discharge valve)組成,排出閥具有狹窄的小孔,其大小可以調(diào)節(jié)。細(xì)胞漿液通過止逆閥進(jìn)入泵體內(nèi),在高壓下迫使其在排出閥的小孔中高速沖出,并射向撞擊環(huán)上,由于突然減壓和高速沖擊,使細(xì)胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上,可以采用單次通過勻漿器或多次循環(huán)通過等方式,也可連續(xù)操作。為了控制溫度的升高,可在進(jìn)口處用干冰調(diào)節(jié)溫度,使出口溫度調(diào)節(jié)在20℃左右。在工業(yè)規(guī)模的細(xì)胞破碎中,對于酵母等難破碎的及濃度高或處于生長靜止期的細(xì)胞,常采用多次循環(huán)的操作方法。
2.振蕩珠擊破碎法 (Skaking Bead)
將等體積的小量組織樣品與高密度的ZircoBeads放入可密封的2ml螺旋蓋微量管中,再加入緩沖液與穩(wěn)定成份到1.5ml的體積, 用6500RPM振蕩機(jī)高速上下振動8,休息8,再振動8即可.此方法是目快且一次可處理多樣品的方法. 一臺機(jī)器多可以在一天處理2400支樣品.對小量且多樣的人很方便!
3.高速攪拌珠研磨破碎法(fine grinding)
研磨是常用的一種方法,它將細(xì)胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁等研磨劑一起快速攪拌,使細(xì)胞獲得破碎。在工業(yè)規(guī)模的破碎中,常采用高速珠磨機(jī) 。
4.超聲波破碎法(ultrasonication)
超聲波破碎法利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。 超聲波振蕩器有不同的類型,常用的為電聲型,它是由發(fā)生器和換能器組成,發(fā)生器能產(chǎn)生高頻電流,換能器的作用是把電磁振蕩轉(zhuǎn)換成機(jī)械振動。超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩種型式,一般破碎效果后者比者好。
非機(jī)械法:
1.滲透壓沖擊破碎法(osmotic shock)
滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法,將細(xì)胞放在高滲透壓的溶液中(如一定濃度的甘油或蔗糖溶液),由于滲透壓的作用,細(xì)胞內(nèi)水分便向外滲出,細(xì)胞發(fā)生收縮,當(dāng)達(dá)到平衡后,將介質(zhì)快速稀釋,或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中,由于滲透壓的突然變化,胞外的水迅速滲入胞內(nèi),引起細(xì)胞快速膨脹而破裂。
2.凍融破碎法(freezing and thawing)
將細(xì)胞放在低溫下冷凍(約-15℃),然后在室溫中融化,反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。由于冷凍,一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂,從而增加細(xì)胞的親水性能,另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶,形成冰晶粒,引起細(xì)胞膨脹而破裂。對于細(xì)胞壁較脆弱的菌體,可采用此法。
3.酶溶破碎法(enzyme lysis)
酶解是利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞,使細(xì)胞壁受到部分或破壞后,再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜,進(jìn)一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。溶菌酶(lysozyme)適用于革蘭氏陰性菌細(xì)胞的分解,應(yīng)用于革蘭氏陽性菌時,需輔以EDTA使之更有效地作用于細(xì)胞壁。 真核細(xì)胞的細(xì)胞壁不同于原核細(xì)胞,需采用不同的酶。
4.化學(xué)破碎法(chemical treatment)
采用化學(xué)法處理可以溶解細(xì)胞或抽提胞內(nèi)組分。常用酸、堿、表面活性劑和有機(jī)溶劑等化學(xué)試劑
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