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點擊次數(shù):53 發(fā)布時間:2024/11/27 9:49:06
ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)預實驗是開展正式實驗前必不可少的環(huán)節(jié),主要用于摸索合適的實驗條件及確定實驗的可行性。以下是ELISA預實驗的開展過程,一起來看看吧!
一、預實驗的目的
確定實驗條件:如抗原或抗體的濃度、酶的種類和濃度、洗滌液的濃度和pH值等,以確保實驗的準確性和可靠性。
確定實驗范圍:包括*佳反應時間和濃度范圍,以確保在正式實驗中獲得*佳的實驗結果。
驗證實驗方法:確保實驗方法的準確性和可靠性。
減少實驗誤差:提高實驗的重復性和可重復性。
二、預實驗的方法
1.實驗樣本的選擇:
預實驗一般通過測定少數(shù)有代表性的樣本來確定正式實驗方案。通常,測定的樣本會分為不同的組別,不同組別的樣本由于前期處理或刺激后,靶標物的表達量會產(chǎn)生變化。建議從各組樣本中隨機選擇1~2例樣本。如果正式實驗測定的樣本數(shù)量多,分配到預實驗的試劑量有限,那么至少選擇兩例樣品,建議選用1例為理論上靶標物含量組的樣品,另1例為理論上靶標物含量組的樣品。
2.*適稀釋倍數(shù)的確定:
①將樣本梯度稀釋,可根據(jù)樣本中靶標物的濃度,選擇2倍、5倍或10倍梯度稀釋,同時測定標準品。
②標準品的制備需按照試劑盒說明書的要求,試劑量充足可以選擇一條完整的標曲,試劑量有限也可以選擇部分濃度點(如空白孔、濃度孔、中間濃度孔以及濃度孔)。
③將測定的不同稀釋濃度的樣本測定的OD值(光密度值)與梯度濃度標準品OD值進行對比,*佳稀釋倍數(shù)為此倍數(shù)稀釋后全部或絕大多數(shù)樣本OD值能夠位于標準曲線中間濃度孔對應的OD值,即標準曲線的*佳擬合區(qū)域。
④在做預實驗時,一定要設置標曲,不設置標曲則無法通過比較確定*適稀釋倍數(shù)。
3.抗原包被濃度的設定:
①將抗原溶液分別按照1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml的濃度稀釋在抗原包被液中。
②以等量隨機選取的特異性抗體血清與抗原溶液反應,在37℃孵育1小時后清洗,然后加酶標二抗,孵育30分鐘清洗,zui hou加底物顯色,反應終止后用酶標儀在450nm波長下測定各孔的光密度值。
③繪制ROC曲線(受試者工作特征曲線),找出臨界值。
4.酶標二抗稀釋比例的確定:
①取已知陽性和陰性血清樣本,分別用ELISA稀釋液將特異性抗體稀釋成不同濃度的酶標二抗溶液,與包被抗原孵育、清洗后加底物顯色,zui hou用酶標儀測定光密度值。
②繪制ROC曲線,找出臨界值。
5.顯色時間的確定:
①顯色是ELISA實驗中zui hou一步溫育反應,固定在酶標板上的酶催化無色底物生成有色產(chǎn)物。
②由于ELISA實驗會受到環(huán)境差異及實驗操作差異的影響,商業(yè)化的ELISA試劑盒通常不會推薦固定的顯色時間,而是建議實驗操作人員根據(jù)顯色情況判斷合適的顯色反應時間。
③加入底物后可定時觀察反應孔的顏色變化(如每隔5分鐘觀察一次),當標準孔的前3~4孔有明顯的梯度藍色,后3~4孔梯度不明顯時,即可終止。通過預實驗熟悉操作的同時,也能確定合適的顯色時間。
三、注意事項
①在進行預實驗時,應嚴格按照ELISA試劑盒的說明書進行操作,避免由于操作不當導致的實驗誤差。
②預實驗的結果應認真記錄和分析,以便為正式實驗提供可靠的依據(jù)。
③在預實驗過程中,如發(fā)現(xiàn)任何異常或不符合預期的結果,應及時查找原因并進行調(diào)整。
通過以上預實驗的設置和操作,可以對ELISA實驗的條件進行初步的摸索和優(yōu)化,為后續(xù)的正式實驗提供可靠的基礎。同時,也能及時發(fā)現(xiàn)實驗中存在的問題,進行針對性的改進,提高實驗的準確性和可靠性。上海恒遠生物專業(yè)提供生命科學領域的技術服務,提供實驗技術服務,為廣大科研工作者大大節(jié)省了重復勞動的時間和精力,我們有過硬的技術咨詢和完善的售后服務,購買ELISA試劑盒贈送免費代測服務,在線一對一技術指導,為您解決后顧之憂。
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